Beamline Commander: À Caça do Cristal

Uma homenagem a Silent Service (Sid Meier, MicroProse, 1985; no ZX Spectrum pela U.S. Gold), o jogo de submarinos em que se navegava a baterias debaixo de água, se vinha à superfície carregá-las com os motores diesel e se dava a posição ao inimigo, se caçavam navios pelo periscópio e se descia fundo e em silêncio quando os contratorpedeiros passavam por cima com as cargas de profundidade. Aqui o submarino é a I04, e o jogador é um biólogo estrutural, ou bióloga, cujo grupo recebeu um turno nela. A cabine aberta é estar “à superfície”: seguro, mas sem raios X. As perdas de feixe, as subidas de calor e as oscilações da órbita são as cargas de profundidade: feche o obturador e espere em silêncio. A dose é o profundímetro: perto dos 30 MGy o cristal range, e acima de 30 MGy cede. Escolher a exposição em vez da dose é navegar às cegas. Quando alguma coisa avaria, liga-se para o piquete da linha de luz. Há também uma biblioteca: os livros certos ajudam até ao fim do turno; os romances são uma maravilha, mas não em tempo de feixe. E o comboio que se caça é uma gota cheia de cristais, dos quais só alguns dão a estrutura.

A ciência

• Os raios X. Um síncrotron como o Diamond mantém electrões a girar num anel de armazenamento quase à velocidade da luz. Num ondulador, filas de ímanes fazem-nos abanar e eles emitem um feixe intenso de raios X; um monocromador de duplo cristal, dois cristais de silício arrefecidos, escolhe uma só energia.
• Na amostra. Lentes refractivas compostas definem o tamanho do feixe, um goniómetro roda o cristal, um jacto de azoto gasoso a cerca de 100 K mantém-no congelado, e um robô troca os cristais a partir de um dewar de azoto líquido. Um detector de contagem de fotões regista as imagens de difracção.
• A pesca. Os cristais de proteínas apanham-se da gota com um minúsculo loop de nylon e mergulham-se em azoto líquido. Congelando depressa, a água fica vítrea; congelando devagar, ou deixando a gota secar, forma gelo cristalino, que deixa anéis nas imagens a cerca de 3,9, 3,7 e 3,4 Å e esconde as manchas da proteína. Fissuras e toques aumentam a mosaicidade, e os agregados de cristais dão duas redes ao mesmo tempo.
• A dose. Os raios X que difractam vêm acompanhados de muitos mais que são absorvidos e danificam o cristal. A dose mede-se em grays, e para cristais de proteínas congelados cerca de 30 MGy é o limite experimental, estabelecido pelo grupo de Elspeth Garman (Owen et al., 2006). Por isso faz-se primeiro um rastreio com pouca dose (aqui uma cunha de 15° a 1 MGy) e planeia-se o resto. A dose certa para um conjunto de dados depende da resolução a que o cristal difracta: na I04, cerca de 5,5, 10 e 16 MGy para 1,3, 1,8 e 2,3 Å, e nunca mais de 30 MGy (os dados anómalos ficam pelos 10 MGy). Avaliar mal a resolução em 0,25 Å muda a dose certa em cerca de 30 %. Por isso, na I04, escolhe-se uma dose-alvo e a exposição é calculada a partir do feixe (o RADDOSE-3D faz as contas): com o feixe habitual, 10 MGy levam cerca de 16 s de exposição total com transmissão total (13 keV). E recolhem-se 360° completos: cada mancha medida várias vezes.
• Demasiado brilhante para contar. Os detectores de contagem de fotões podem perder fotões que chegam muito juntos. A correcção funciona até um limite, a gama fiável; para lá dele, as manchas mais fortes são contadas de menos, e como todas as suas cópias são contadas de menos da mesma forma, as estatísticas de merging continuam a parecer excelentes (Donath et al., 2023). A solução, que ensinamos nas nossas formações na I04: verificar as manchas mais brilhantes da cunha de rastreio, baixar a transmissão e prolongar a exposição pelo mesmo factor. A mesma dose, todos os fotões contados. Pode experimentar o modelo interactivo (eiger-countrate-dose-demo).
• Agulhas. Os danos são locais: num cristal comprido, um varrimento helicoidal faz deslizar o cristal ao longo do feixe enquanto roda, para que cada parte receba só a sua parte da dose. A largura do feixe define quantos sítios frescos cabem ao longo da agulha.
• Simetria. O grupo espacial diz como um cristal se repete. Um cristal simétrico dá cópias de cada mancha, por isso basta uma rotação curta; um cristal triclínico P 1 não tem nenhuma, precisa de uma volta completa e, como um só eixo de rotação deixa sempre uma região cega, de uma segunda passagem com outra inclinação. Uma célula unitária enorme, como a de uma cápside de vírus, amontoa as manchas.
• Resolver. Os dados são processados automaticamente; a substituição molecular coloca um modelo conhecido e parecido no novo cristal, e os átomos são construídos na densidade electrónica. À energia de ionização de um elemento (7,112 keV para o ferro), os átomos dispersam de forma um pouco diferente (dispersão anómala), o que mostra onde estão. As diferenças são pequenas, por isso na I04 os dados anómalos recolhem-se com suavidade e de várias direcções: 10 MGy no total, em três cunhas de 360° com orientações χ diferentes do goniómetro.
• As quatro estruturas.
  • A BCL-2 mantém as células vivas, e algumas células de leucemia fazem demasiada. O venetoclax, um medicamento que nasceu da investigação no WEHI, em Melbourne, bloqueia-a e as células do cancro morrem. O grupo de Peter Czabotar resolveu a BCL-2 com venetoclax para perceber porque é que o medicamento deixa de funcionar em alguns doentes (Birkinshaw et al., 2019).
  • A protease principal do SARS-CoV-2 corta as proteínas do vírus em peças que funcionam; o nirmatrelvir bloqueia-a. As estruturas com o centro activo vazio (veja a página da estrutura) foram o ponto de partida para um grande rastreio de fragmentos (Douangamath et al., 2020).
  • O vírus da doença do bico e das penas ameaça papagaios em perigo, como o papagaio-de-barriga-laranja. Com o grupo de Jade Forwood resolvemos estruturas da sua cápside, um ponto de partida para uma vacina (página da estrutura).
  • A proteína de cluster híbrido de Desulfovibrio tem um cluster invulgar de ferro, enxofre e oxigénio; a proteína reduzida de D. desulfuricans cristalizou em P 1, e fez parte do meu doutoramento (página da estrutura).

Onde o jogo faz um bocadinho de batota

• O tempo de feixe anda aos saltos: uma revista da cabine, uma montagem ou um conjunto de dados levam um número fixo de minutos, e a construção do modelo leva 40. A construção de um modelo a sério leva dias, às vezes meses, e muito mais do que uma rotação e um empurrão.
• Os anéis de armazenamento são muito estáveis: a retroacção mantém o feixe no sítio ao micrómetro, e quando alguma coisa corre mal a linha de luz fecha ela própria o obturador. Ficar em silêncio é puro submarino.
• Os dewars dos robôs costumam ser atestados automaticamente, e os pucks verdadeiros levam 16 cristais, não 4.
• A verificação da velocidade de contagem usa na verdade um percentil alto das contagens dos píxeis nas manchas fortes, comparado com a gama fiável guardada no ficheiro de dados; o jogo reduz cada cristal a um só número de brilho.
• No jogo, a taxa de dose sobe simplesmente com o quadrado da redução do feixe, e as manchas deixam de se sobrepor quando a distância do detector em milímetros passa a aresta da célula em ångströms. As lentes, os feixes e as manchas verdadeiras são mais complicados, e é para isso que existe o RADDOSE-3D e muita geometria.
• Uma só passagem de um cristal P 1 dá muitas vezes mais de 90 % de completude; o jogo aumenta a região cega, para que a segunda passagem conte.
• As avarias verdadeiras são mais raras do que no jogo, e o piquete nem sempre resolve tudo num quarto de hora. Mas atende o telefone a meio da noite.
• Ler Cristalografia para Totós em 40 minutos não deixa as mãos de ninguém mais firmes ao microscópio. A prática sim (e os livros também ajudam).
• O café não acelera as mãos de ninguém exactamente o mesmo a cada chávena. Provavelmente.