Beamline Commander: A la caza del cristal

Un guiño a Silent Service (Sid Meier, MicroProse, 1985; en el ZX Spectrum de la mano de U.S. Gold), el juego de submarinos en el que navegabas con baterías bajo el agua, salías a superficie a cargarlas con los diésel y te delatabas, cazabas barcos por el periscopio y bajabas hondo y en silencio cuando los destructores pasaban por encima con sus cargas de profundidad. Aquí el submarino es I04, y te dedicas a la biología estructural en un grupo que ha conseguido un turno en ella. La cabina abierta es estar «en superficie»: a salvo, pero sin rayos X. Las caídas del haz, los golpes de calor y las oscilaciones de la órbita son las cargas de profundidad: cierra el obturador y espera en silencio. La dosis es el profundímetro: cerca de 30 MGy el cristal cruje, y por encima de 30 MGy cede. Fijar la exposición en vez de la dosis es navegar a ciegas. Cuando algo se avería, se llama a la guardia de la línea. También hay una biblioteca: los libros buenos ayudan hasta el final del turno; las novelas son una maravilla, pero no en tiempo de haz. Y el convoy que cazas es una gota llena de cristales, de los que solo algunos te darán la estructura.

La ciencia

• Los rayos X. Un sincrotrón como Diamond mantiene electrones girando en un anillo de almacenamiento casi a la velocidad de la luz. En un ondulador, filas de imanes los hacen ondular y emiten un haz intenso de rayos X; un monocromador de doble cristal, dos cristales de silicio refrigerados, escoge una sola energía.
• En la muestra. Unas lentes refractivas compuestas fijan el tamaño del haz, un goniómetro gira el cristal, un chorro de nitrógeno gaseoso a unos 100 K lo mantiene congelado, y un robot cambia los cristales desde un dewar de nitrógeno líquido. Un detector de recuento de fotones registra las imágenes de difracción.
• La pesca. Los cristales de proteínas se sacan de su gota con un diminuto loop de nailon y se sumergen en nitrógeno líquido. Si se congelan deprisa, el agua queda vítrea; si se congelan despacio, o si la gota se seca, se forma hielo cristalino, que deja anillos en las imágenes hacia 3,9, 3,7 y 3,4 Å y tapa las manchas de la proteína. Las grietas y los golpes aumentan la mosaicidad, y los agregados de cristales dan dos redes a la vez.
• La dosis. Los rayos X que difractan vienen con muchos más que se absorben y dañan el cristal. La dosis se mide en grays, y para cristales de proteínas congelados unos 30 MGy es el límite experimental, establecido por el grupo de Elspeth Garman (Owen et al., 2006). Así que primero se hace un cribado con poca dosis (aquí una cuña de 15° a 1 MGy) y luego se planifica el resto. La dosis que conviene a un conjunto de datos depende de la resolución a la que difracta el cristal: en I04, unos 5,5, 10 y 16 MGy para 1,3, 1,8 y 2,3 Å, y nunca más de 30 MGy (los datos anómalos se quedan en 10 MGy). Calcular mal la resolución en 0,25 Å cambia la dosis correcta en torno a un 30 %. Por eso en I04 se fija una dosis objetivo y la exposición se calcula a partir del haz (RADDOSE-3D hace las cuentas): con el haz por defecto, 10 MGy necesitan unos 16 s de exposición total con transmisión completa (13 keV). Y se toman 360° completos: cada mancha medida varias veces.
• Demasiado brillante para contar. Los detectores de recuento de fotones pueden perder fotones que llegan demasiado juntos. Su corrección funciona hasta un límite, el rango fiable; más allá, las manchas más fuertes se cuentan de menos, y como todas sus copias se cuentan de menos igual, las estadísticas de merging siguen pareciendo excelentes (Donath et al., 2023). El remedio, que enseñamos en nuestros cursos en I04: comprobar las manchas más brillantes de la cuña de cribado, bajar la transmisión y alargar la exposición por el mismo factor. La misma dosis, todos los fotones contados. Puedes probar el modelo interactivo (eiger-countrate-dose-demo).
• Agujas. El daño es local: en un cristal largo, un barrido helicoidal desliza el cristal a lo largo del haz mientras gira, para que cada parte reciba solo su parte de la dosis. La anchura del haz fija cuántos sitios frescos caben a lo largo de la aguja.
• La simetría. El grupo espacial dice cómo se repite un cristal. Un cristal simétrico da copias de cada mancha, así que basta con una rotación corta; un cristal triclínico P 1 no tiene ninguna, necesita una vuelta completa y, como un solo eje de rotación deja siempre una región ciega, una segunda pasada con otra inclinación. Una celda unidad enorme, como la de una cápside de virus, amontona las manchas.
• Resolver. Los datos se procesan automáticamente; el reemplazo molecular coloca un modelo conocido y parecido en el cristal nuevo, y los átomos se construyen en la densidad electrónica. En el borde de absorción de un elemento (7,112 keV para el hierro), sus átomos dispersan de forma un poco distinta (dispersión anómala), lo que muestra dónde están. Las diferencias son pequeñas, así que en I04 los datos anómalos se toman con suavidad y desde varias direcciones: 10 MGy en total, en tres cuñas de 360° con orientaciones χ distintas del goniómetro.
• Las cuatro estructuras.
  • BCL-2 mantiene vivas las células, y algunas células de leucemia fabrican muchísima. El venetoclax, un fármaco nacido de la investigación en el WEHI de Melbourne, la bloquea y las células del cáncer mueren. El grupo de Peter Czabotar resolvió BCL-2 con venetoclax para entender por qué el fármaco deja de funcionar en algunos pacientes (Birkinshaw et al., 2019).
  • La proteasa principal del SARS-CoV-2 corta las proteínas del virus en piezas que funcionan; el nirmatrelvir la bloquea. Las estructuras con el centro activo vacío (mira la página de la estructura) fueron el punto de partida de un gran cribado de fragmentos (Douangamath et al., 2020).
  • El virus de la enfermedad del pico y las plumas amenaza a loros en peligro como el periquito ventrinaranja. Con el grupo de Jade Forwood resolvimos estructuras de su cápside, un punto de partida para una vacuna (página de la estructura).
  • La proteína de clúster híbrido de Desulfovibrio tiene un clúster poco común de hierro, azufre y oxígeno; la proteína reducida de D. desulfuricans cristalizó en P 1, y formó parte de mi tesis (página de la estructura).

Donde el juego hace un poco de trampa

• El tiempo de haz avanza a saltos: una revisión de la cabina, un montaje o un conjunto de datos llevan un número fijo de minutos, y construir el modelo lleva 40. Construir un modelo de verdad lleva días, a veces meses, y mucho más que un giro y un empujoncito.
• Los anillos de almacenamiento son muy estables: la realimentación mantiene el haz en su sitio al micrómetro, y cuando algo va mal la línea cierra sola su obturador. Lo de guardar silencio es puro submarino.
• Los dewars de los robots suelen rellenarse solos, y los pucks de verdad llevan 16 cristales, no 4.
• La comprobación de la tasa de recuento usa en realidad un percentil alto de los recuentos de los píxeles de las manchas fuertes, comparado con el rango fiable guardado en el fichero de datos; el juego reduce cada cristal a un solo número de brillo.
• En el juego, la tasa de dosis sube sin más con el cuadrado de lo que se reduce el haz, y las manchas dejan de solaparse en cuanto la distancia del detector en milímetros supera la arista de la celda en ångströms. Las lentes, los haces y las manchas de verdad son más complicados, y para eso están RADDOSE-3D y mucha geometría.
• Una sola pasada de un cristal P 1 da a menudo más del 90 % de completitud; el juego agranda la región ciega, para que la segunda pasada cuente.
• Las averías de verdad son más raras que en el juego, y la guardia no siempre lo arregla todo en un cuarto de hora. Pero coge el teléfono en mitad de la noche.
• Leer Cristalografía para Dummies en 40 minutos no le da a nadie manos más firmes en el microscopio. La práctica sí (y los libros también ayudan).
• El café no acelera las manos de nadie exactamente lo mismo con cada taza. Probablemente.