Beamline Commander : La Chasse au cristal

Un clin d’œil à Silent Service (Sid Meier, MicroProse, 1985 ; sur ZX Spectrum chez U.S. Gold), le jeu de sous-marin où l’on naviguait sur batteries en plongée, où l’on remontait en surface les recharger au diesel en se faisant repérer, où l’on chassait les navires au périscope, et où l’on plongeait profond et en silence quand les destroyers passaient au-dessus avec leurs grenades sous-marines. Ici, le sous-marin, c’est I04, et tu fais de la biologie structurale dans une équipe qui a obtenu une session dessus. La cabane ouverte, c’est être « en surface » : à l’abri, mais sans rayons X. Les pertes de faisceau, les coups de chaleur et les oscillations de l’orbite sont les grenades sous-marines : ferme l’obturateur et attends en silence. La dose, c’est le profondimètre : près de 30 MGy le cristal grince, et au-delà de 30 MGy il lâche. Régler l’exposition au lieu de la dose, c’est naviguer à l’aveugle. Quand quelque chose tombe en panne, on appelle l’astreinte de la ligne. Il y a aussi une bibliothèque : les bons livres aident jusqu’à la fin de la session ; les romans sont merveilleux, mais pas pendant le temps de faisceau. Et le convoi que tu chasses, c’est une goutte pleine de cristaux, dont seuls quelques-uns te donneront la structure.

La science

• Les rayons X. Une source de lumière synchrotron comme Diamond fait tourner des électrons dans un anneau de stockage à presque la vitesse de la lumière. Dans un onduleur, des rangées d’aimants les font onduler et ils émettent un faisceau intense de rayons X ; un monochromateur à double cristal, deux cristaux de silicium refroidis, en choisit une seule énergie.
• Sur l’échantillon. Des lentilles réfractives composées fixent la taille du faisceau, un goniomètre fait tourner le cristal, un jet d’azote gazeux à environ 100 K le garde congelé, et un robot change les cristaux depuis un dewar d’azote liquide. Un détecteur à comptage de photons enregistre les images de diffraction.
• La récolte. Les cristaux de protéines sont cueillis dans leur goutte avec une minuscule boucle de nylon et plongés dans l’azote liquide. Congelée vite, l’eau reste vitreuse ; congelée lentement, ou si la goutte sèche, elle forme de la glace cristalline, qui met des anneaux sur les images vers 3,9, 3,7 et 3,4 Å et cache les taches de la protéine. Les fissures et les coups augmentent la mosaïcité, et les agrégats de cristaux donnent deux réseaux à la fois.
• La dose. Les rayons X qui diffractent s’accompagnent de bien d’autres qui sont absorbés et abîment le cristal. La dose se mesure en grays, et pour les cristaux de protéines congelés, environ 30 MGy est la limite expérimentale, établie par l’équipe d’Elspeth Garman (Owen et al., 2006). On teste donc d’abord avec une petite dose (ici un coin de 15° à 1 MGy) avant de planifier le reste. La bonne dose pour un jeu de données dépend de la résolution à laquelle le cristal diffracte : sur I04, environ 5,5, 10 et 16 MGy pour 1,3, 1,8 et 2,3 Å, et jamais plus de 30 MGy (les données anomales s’arrêtent à 10 MGy). Se tromper de 0,25 Å sur la résolution change la bonne dose d’environ 30 %. Sur I04, on fixe donc une dose cible et l’exposition est calculée à partir du faisceau (RADDOSE-3D fait les calculs) : avec le faisceau par défaut, 10 MGy demandent environ 16 s d’exposition totale à pleine transmission (13 keV). Et on collecte 360° complets : chaque tache mesurée plusieurs fois.
• Trop brillant pour compter. Les détecteurs à comptage de photons peuvent rater des photons qui arrivent trop rapprochés. Leur correction marche jusqu’à une limite, la plage fiable ; au-delà, les taches les plus fortes sont sous-comptées, et comme toutes leurs copies le sont de la même façon, les statistiques de fusion ont toujours l’air excellentes (Donath et al., 2023). Le remède, que nous enseignons dans nos formations sur I04 : vérifier les taches les plus brillantes du coin de test, baisser la transmission et allonger l’exposition du même facteur. Même dose, chaque photon compté. Tu peux essayer le modèle interactif toi-même (eiger-countrate-dose-demo).
• Aiguilles. Les dommages sont locaux : sur un long cristal, un balayage hélicoïdal fait glisser le cristal le long du faisceau pendant qu’il tourne, pour que chaque partie ne reçoive que sa part de la dose. La largeur du faisceau fixe combien de zones fraîches tiennent le long de l’aiguille.
• La symétrie. Le groupe d’espace dit comment un cristal se répète. Un cristal symétrique donne des copies de chaque tache, donc une courte rotation suffit ; un cristal triclinique P 1 n’en a aucune, il lui faut un tour complet et, comme un seul axe de rotation laisse toujours une zone aveugle, un second balayage avec une autre inclinaison. Une maille énorme, comme celle d’une capside de virus, serre les taches les unes contre les autres.
• La résolution. Les données sont traitées automatiquement ; le remplacement moléculaire place un modèle connu et proche dans le nouveau cristal, et les atomes sont construits dans la densité électronique. Au seuil d’absorption d’un élément (7,112 keV pour le fer), ses atomes diffusent un peu différemment (diffusion anomale), ce qui montre où ils sont. Les différences sont petites, donc sur I04 les données anomales se collectent en douceur et sous plusieurs angles : 10 MGy en tout, en trois coins de 360° à des orientations χ différentes du goniomètre.
• Les quatre structures.
  • BCL-2 maintient les cellules en vie, et certaines cellules de leucémie en fabriquent beaucoup trop. Le vénétoclax, un médicament né de recherches à l’Institut Walter et Eliza Hall (WEHI) de Melbourne, la bloque et les cellules cancéreuses meurent. L’équipe de Peter Czabotar a résolu BCL-2 avec le vénétoclax pour comprendre pourquoi le médicament cesse d’agir chez certains patients (Birkinshaw et al., 2019).
  • La protéase principale du SARS-CoV-2 découpe les protéines du virus en pièces qui fonctionnent ; le nirmatrelvir la bloque. Les structures au site actif vide (voir la page de la structure) ont servi de point de départ à un grand criblage de fragments (Douangamath et al., 2020).
  • Le virus de la maladie du bec et des plumes menace des perroquets en danger comme la perruche à ventre orange. Avec l’équipe de Jade Forwood, nous avons résolu des structures de sa capside, un point de départ pour un vaccin (page de la structure).
  • La protéine à cluster hybride de Desulfovibrio contient un cluster inhabituel de fer, de soufre et d’oxygène ; la protéine réduite de D. desulfuricans a cristallisé en P 1, et elle faisait partie de ma thèse (page de la structure).

Là où le jeu triche un peu

• Le temps de faisceau avance par sauts : une fouille de la cabane, un montage ou un jeu de données prennent chacun un nombre fixe de minutes, et la construction du modèle en prend 40. Une vraie construction de modèle prend des jours, parfois des mois, et bien plus qu’une rotation et un petit coup de pouce.
• Les anneaux de stockage sont très stables : une rétroaction garde le faisceau en place au micromètre près, et quand quelque chose tourne mal, la ligne ferme elle-même son obturateur. Faire silence, c’est du pur sous-marin.
• Les dewars des robots se remplissent en général tout seuls, et les vrais pucks contiennent 16 cristaux, pas 4.
• La vérification du taux de comptage utilise en réalité un percentile élevé des comptages des pixels dans les taches fortes, comparé à la plage fiable stockée dans le fichier de données ; le jeu réduit chaque cristal à un seul nombre de brillance.
• Dans le jeu, le débit de dose monte simplement avec le carré de la réduction du faisceau, et les taches cessent de se chevaucher dès que la distance du détecteur en millimètres dépasse l’arête de la maille en ångströms. Les vraies lentilles, les vrais faisceaux et les vraies taches sont plus compliqués, d’où RADDOSE-3D et beaucoup de géométrie.
• Un seul balayage d’un cristal P 1 donne souvent plus de 90 % de complétude ; le jeu agrandit la zone aveugle, pour que le second balayage compte.
• Les vraies pannes sont plus rares que dans le jeu, et l’astreinte ne peut pas toujours tout régler en un quart d’heure. Mais elle décroche au milieu de la nuit.
• Lire La Cristallographie pour les Nuls en 40 minutes ne rend les mains de personne plus sûres au microscope. La pratique, si (et les livres aident aussi).
• Le café n’accélère pas les mains de tout le monde exactement autant à chaque tasse. Probablement.