Beamline Commander: Caccia al cristallo

Un omaggio a Silent Service (Sid Meier, MicroProse, 1985; su ZX Spectrum con U.S. Gold), il gioco di sottomarini in cui si navigava a batterie sott’acqua, si risaliva in superficie a ricaricarle con i diesel facendosi scoprire, si cacciavano le navi al periscopio e si scendeva in profondità e in silenzio quando i cacciatorpediniere passavano sopra con le bombe di profondità. Qui il sottomarino è I04, e tu ti occupi di biologia strutturale in un gruppo che ci ha ottenuto un turno. La cabina aperta è stare «in superficie»: al sicuro, ma senza raggi X. Le perdite del fascio, i colpi di calore e le oscillazioni dell’orbita sono le bombe di profondità: chiudi l’otturatore e aspetta in silenzio. La dose è il profondimetro: vicino ai 30 MGy il cristallo scricchiola, e oltre i 30 MGy cede. Impostare l’esposizione invece della dose è navigare alla cieca. Quando qualcosa si guasta, si chiama il servizio di reperibilità della linea. C’è anche una biblioteca: i libri giusti aiutano fino alla fine del turno; i romanzi sono meravigliosi, ma non durante il tempo fascio. E il convoglio a cui dai la caccia è una goccia piena di cristalli, e solo alcuni ti daranno la struttura.

La scienza

• I raggi X. Un sincrotrone come Diamond fa girare gli elettroni in un anello di accumulazione quasi alla velocità della luce. In un ondulatore, file di magneti li fanno ondeggiare ed emettono un fascio intenso di raggi X; un monocromatore a doppio cristallo, due cristalli di silicio raffreddati, ne sceglie una sola energia.
• Sul campione. Delle lenti rifrattive composte fissano la dimensione del fascio, un goniometro fa ruotare il cristallo, un getto di azoto gassoso a circa 100 K lo tiene congelato, e un robot scambia i cristalli da un dewar di azoto liquido. Un rivelatore a conteggio di fotoni registra le immagini di diffrazione.
• La pesca. I cristalli di proteine (vedi la cristallizzazione delle proteine) si prendono dalla goccia con un minuscolo loop di nylon e si immergono nell’azoto liquido. Congelando in fretta, l’acqua resta vetrosa; congelando piano, o se la goccia si secca, si forma ghiaccio cristallino, che lascia anelli sulle immagini verso 3,9, 3,7 e 3,4 Å e nasconde le macchie della proteina. Crepe e urti aumentano la mosaicità, e gli aggregati di cristalli danno due reticoli insieme.
• La dose. I raggi X che diffrangono arrivano con molti altri che vengono assorbiti e danneggiano il cristallo. La dose si misura in gray, e per i cristalli di proteine congelati circa 30 MGy è il limite sperimentale, stabilito dal gruppo di Elspeth Garman (Owen et al., 2006). Per questo si fa prima uno screening con poca dose (qui uno spicchio di 15° a 1 MGy) e poi si pianifica il resto. La dose adatta a un set di dati dipende dalla risoluzione a cui diffrange il cristallo: su I04, circa 5,5, 10 e 16 MGy per 1,3, 1,8 e 2,3 Å, e mai più di 30 MGy (i dati anomali si fermano a 10 MGy). Sbagliare la risoluzione di 0,25 Å cambia la dose giusta di circa il 30 %. Così su I04 si imposta una dose obiettivo e l’esposizione viene calcolata dal fascio (RADDOSE-3D fa i conti): con il fascio predefinito, 10 MGy richiedono circa 16 s di esposizione totale a piena trasmissione (13 keV). E si raccolgono 360° completi: ogni macchia misurata più volte.
• Troppo brillante per contare. I rivelatori a conteggio di fotoni possono perdere fotoni che arrivano troppo vicini. La loro correzione funziona fino a un limite, l’intervallo affidabile; oltre, le macchie più forti vengono contate meno del vero, e siccome tutte le loro copie lo sono allo stesso modo, le statistiche di merging sembrano comunque ottime (Donath et al., 2023). Il rimedio, che insegniamo nei nostri corsi su I04: controllare le macchie più brillanti dello spicchio di screening, abbassare la trasmissione e allungare l’esposizione dello stesso fattore. Stessa dose, ogni fotone contato. Puoi provare tu stesso, o tu stessa, il modello interattivo (eiger-countrate-dose-demo).
• Aghi. Il danno è locale: su un cristallo lungo, una scansione elicoidale fa scorrere il cristallo lungo il fascio mentre ruota, così ogni parte riceve solo la sua quota di dose. La larghezza del fascio stabilisce quanti punti freschi entrano lungo l’ago.
• La simmetria. Il gruppo spaziale dice come si ripete un cristallo. Un cristallo simmetrico dà copie di ogni macchia, quindi basta una rotazione breve; un cristallo triclino P 1 non ne ha nessuna, ha bisogno di un giro completo e, poiché un solo asse di rotazione lascia sempre una regione cieca, di un secondo passaggio con un’altra inclinazione. Una cella unitaria enorme, come quella di un capside virale, affolla le macchie.
• Risolvere. I dati vengono elaborati automaticamente; la sostituzione molecolare colloca un modello noto e simile nel nuovo cristallo, e gli atomi vengono costruiti nella densità elettronica. Alla soglia di assorbimento di un elemento (7,112 keV per il ferro), i suoi atomi diffondono in modo un po’ diverso (diffusione anomala), il che mostra dove sono. Le differenze sono piccole, quindi su I04 i dati anomali si raccolgono con delicatezza e da più direzioni: 10 MGy in tutto, in tre spicchi di 360° con orientazioni χ diverse del goniometro.
• Le quattro strutture.
  • BCL-2 tiene in vita le cellule, e alcune cellule di leucemia ne producono troppa. Il venetoclax, un farmaco nato dalla ricerca al WEHI di Melbourne, la blocca e le cellule tumorali muoiono. Il gruppo di Peter Czabotar ha risolto BCL-2 con venetoclax per capire perché il farmaco smette di funzionare in alcuni pazienti (Birkinshaw et al., 2019).
  • La proteasi principale di SARS-CoV-2 taglia le proteine del virus in pezzi funzionanti; il nirmatrelvir la blocca. Le strutture con il sito attivo vuoto (vedi la pagina della struttura) sono state il punto di partenza per un grande screening di frammenti (Douangamath et al., 2020).
  • Il virus della malattia del becco e delle penne minaccia pappagalli in pericolo come il parrocchetto ventrearancio. Con il gruppo di Jade Forwood abbiamo risolto strutture del suo capside, un punto di partenza per un vaccino (pagina della struttura).
  • La proteina a cluster ibrido di Desulfovibrio ha un insolito cluster di ferro, zolfo e ossigeno; la proteina ridotta di D. desulfuricans ha cristallizzato in P 1, e faceva parte del mio dottorato (pagina della struttura).

Dove il gioco bara un po’

• Il tempo fascio avanza a salti: un’ispezione della cabina, un montaggio o un set di dati richiedono un numero fisso di minuti, e costruire il modello ne richiede 40. Costruire davvero un modello richiede giorni, a volte mesi, e molto più di una rotazione e una spintarella.
• Gli anelli di accumulazione sono molto stabili: la retroazione tiene il fascio al suo posto al micrometro, e quando qualcosa va storto la linea chiude da sola l’otturatore. Fare silenzio è puro sottomarino.
• I dewar dei robot di solito si rabboccano da soli, e i puck veri tengono 16 cristalli, non 4.
• Il controllo della velocità di conteggio usa in realtà un percentile alto dei conteggi dei pixel nelle macchie forti, confrontato con l’intervallo affidabile salvato nel file di dati; il gioco riduce ogni cristallo a un solo numero di brillantezza.
• Nel gioco, il rateo di dose sale semplicemente con il quadrato della riduzione del fascio, e le macchie smettono di sovrapporsi appena la distanza del rivelatore in millimetri supera lo spigolo della cella in ångström. Lenti, fasci e macchie veri sono più complicati, ed è per questo che esistono RADDOSE-3D e tanta geometria.
• Un solo passaggio di un cristallo P 1 dà spesso più del 90 % di completezza; il gioco ingrandisce la regione cieca, perché il secondo passaggio conti.
• I guasti veri sono più rari che nel gioco, e la reperibilità non sempre sistema tutto in un quarto d’ora. Ma risponde al telefono anche nel cuore della notte.
• Leggere Cristallografia for Dummies in 40 minuti non rende più ferme le mani di nessuno al microscopio. La pratica sì (e anche i libri aiutano).
• Il caffè non accelera le mani di nessuno esattamente della stessa misura a ogni tazza. Probabilmente.